银河星尘

http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/human_promoter.affx

Probes are tiled at an average resolution of 35 bp, as measured from the central position of adjacent 25-mer oligos, leaving a gap of approximately 10 bp between probes. Each promoter region covers approximately 7.5 kb upstream through 2.45 kb downstream of 5′ transcription start sites. For over 1,300 cancer-associated genes, coverage of promoter regions was expanded to include additional genomic content. This more extensive coverage spans from 10 kb upstream through 2.45 kb downstream of transcriptional start sites.

The array interrogates regions proximal to transcription start sites and contains probes for approximately 59 percent of CpG islands annotated by UCSC in NCBI human genome assembly (Build 34). The probes selected for the Human Promoter 1.0R Array are a subset of the probes used in the whole-genome ChIP array set, the GeneChip® Human Tiling 2.0R Array Set (P/N 900772).

如何查找一个基因的启动子序列
关键词： 基因 启动子序列 软件

定义：启动子是参与特定基因转录及其调控的DNA序列。包含核心启动子区域和调控区域。核心启动子区域产生基础水平的转录，调控区域能够对不同的环境条件作出应答，对基因的表达水平做出相应的调节。
区域：启动子的范围非常大，可以包含转录起始位点上游2000bp，有些特定基因的转录区内部也存在着转录因子的结合位点，因此也属于启动子范围。

这项搜寻要从UCSC基因组浏览器开始，网址为http://genome.ucsc.edu/。以编码pendrin (PDS)的基因为例来说明上述问题。PDS与耳蜗的异常发育、感觉神经性听力下降以及弥散性甲状腺增大（甲状腺肿）有关。

　　进入UCSC的主页后，在Organism的下拉菜单中选择Human，然后点击Browser。使用者现在到了人类基因组浏览器入口。本例的搜寻很简单：在assembly的下拉菜单中选择Dec. 2001，在position框中键入pendrin，然后点击Submit。返回的页面结果显示一个已知的基因和两个mRNA序列。继续点击mRNA序列的登录号AF030880，出现包含这个mRNA区域的图解概要。为了获得这个区域更清晰的图像，点击紧靠zoom out的1.5X按钮。最后点击页面中部的reset all按钮，使各个路径的设置恢复默认状态。

　　然而，对于本例的搜寻目的来说，默认设置不是理想的设置。按照视图利用页面底部的Track Controls按纽，将一些路径设置为hide模式（即不显示），其他设置为dense模式（所有资料密集在一条直线上）；另一些路径设置为full模式（每个特征有一个分开的线条，最多达300）。在考虑这些路径内究竟存在那些资料之前，对这些路径的内容和表现做一个简要的讨论是必要的，许多这些讨论是由外界提供给UCSC的。下面是对基因预测方法的更进一步讨论，这些信息也可以在其他地方找到。

　　对于Known Genes（已知基因）和预测的基因路径来说，一般的惯例是以一个高的垂直线或块状表示每个编码外显子，以短的垂直线或块状表示5′端和3′端非翻译区。

　　起连接作用的内含子以非常细的线条表示。翻译的方向由沿着细线的箭头指示。

　　Known Genes来自LocusLink内的mRNA参照序列，已经利用BLAT程序将这些序列与基因组序列进行比对排列。

　　Acembly Gene Predictions With Alt-splicing路径是利用Acembly程序将人类mRNA和EST序列数据与人类基因组序列进行比对排列而来的。Acembly程序试图找到mRNA与基因组序列的最好的比对排列以及判断选择性剪接模型。假如有多于1个的基因模型具有统计学意义，则它们都全部显示出来。有关Acembly的更多信息可以在NCBI的网站找到（http://www.ncbi.nih.gov/IEB/Research/Acembly/）。

　　Ensembl Gene Predictions路径由Ensembl提供。Ensembl基因通过许多方法来预测，包括与已知mRNA和蛋白质进行同源性比较，ab initio基因预测使用GENSCAN和基因预测HMMs。 http://www.ebi.ac.uk/ensembl/

　　Fgenesh++ Gene Predictions路径通过寻找基因的结构特征来预测基因内部的外显子，例如剪接位点的给位和受位的结构特征，利用一种动态的程序算法推定编码区域和推定外显子5′端和3′端的内含子区域；这个方法也考虑到蛋白质相似性的资料。

　　Genscan Gene Predictions路径由GENSCAN方法衍生而来，通过这个方法，可以确定内含子、外显子、启动子区域和poly(A)信号。此时，这个方法并不期望查询的序列只出现1个基因，因此可以对部分基因或被基因之间的DNA分隔的多个基因进行准确的预测。

　　Human mRNAs from Genbank路径显示基因库的人类mRNAs与基因组序列的比对排列。

　　Spliced ESTs和Human EST路径显示来自GenBank的ESTs序列与基因组的序列对齐比较。由于ESTs通常代表了转录基因的片断，一个EST很有可能对应于某个外显子区。

　　最后，Repeating Elements by RepeatMasker这个路径显示的是重复元件，例如散在的或长或短的核元素(SINEs和LINEs)，长末端重复序列(LTRs)和低复杂性区域(http://repeatmasker.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker)。一般来说，在将基因预测方法应用于核苷酸序列之前，需要去掉或掩饰这些成分。

　　回到视图显示的例子，可以看到大多数路径返回了几乎同样的基因预测结果。作为一个规则，通过多种方法预测的外显子提高了预测的正确率而不会出现“假阳性”结果。多数方法显示3′端非翻译区，以左侧大而短的块状表示。Acembly路径显示除了全长序列产物（如这个部分第3条线所示）之外还有3个可能的选择性剪接，其它大多数路径显示与此预测结果相符。Genscan路径从左、右方向往远处延伸：GENSCAN可以被用于预测多个基因。

　　尽管这些图解概要很有用，然而研究者更需要与这些垂直线或块状相对应的序列。以此为例，用Fgenesh++预测作为获得原始序列数据的基础，但不管选择哪个路径其步骤都是一样的。点击标有Fgenesh++ Gene Predictions的路径，出现的是一个描述预测的概要页面。

　　序列的区域与pendrin基因相似（从这个例子一开始就已经知道了）。给出了序列的大小及序列开始和结束的预测，并显示预测是以负链为基础的。想要获得序列，点击Genomic Sequence。使用者将被带到一个标题为Get Genomic Sequence Near Gene的查询页面，在这个页面上，可以获得转录物、编码区、启动子或转录物加启动子的序列。

　　点击Transcript返回的页面显示完整的转录子，外显子以大写字母表示。

　　点击Coding Region Only得到的是编码区,外显子以大写字母表示。

　　点击Transcript + Promoter，返回的页面显示的是在上述选择Transcript所获序列的5′端添加了启动子序列，以大写字母表示外显子。启动子的长度显示在文本框内。

　　点击Promoter返回的页面正好是启动子区

核酸和蛋白质序列分析
关键词： 核酸序列 蛋白质序列 分析 软件

在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信息，从而指导进一步的实验研究。通过染色体定位分析、内含子／外显子分析、ORF分析、表达谱分析等，能够阐明基因的基本信息。通过启动子预测、CpG岛分析和转录因子分析等，识别调控区的顺式作用元件，可以为基因的调控研究提供基础。通过蛋白质基本性质分析，疏水性分析，跨膜区预测，信号肽预测，亚细胞定位预测，抗原性位点预测，可以对基因编码蛋白的性质作出初步判断和预测。尤其通过疏水性分析和跨膜区预测可以预测基因是否为膜蛋白，这对确定实验研究方向有重要的参考意义。此外，通过相似性搜索、功能位点分析、结构分析、查询基因表达谱聚簇数据库、基因敲除数据库、基因组上下游邻居等，尽量挖掘网络数据库中的信息，可以对基因功能作出推论。上述技术路线可为其它类似分子的生物信息学分析提供借鉴。本路线图及推荐网址已建立超级链接，放在北京大学人类疾病基因研究中心网站（http://gene.bjmu.edu.cn/science/bioinfomatics.htm ）,可以直接点击进入检索网站。
  下面介绍其中一些基本分析。值得注意的是，在对序列进行分析时，首先应当明确序列的性质,是mRNA序列还是基因组序列？是计算机拼接得到还是经过PCR扩增测序得到？是原核生物还是真核生物？这些决定了分析方法的选择和分析结果的解释。
（一）核酸序列分析
1、双序列比对（pairwise alignment）
  双序列比对是指比较两条序列的相似性和寻找相似碱基及氨基酸的对应位置，它是用计算机进行序列分析的强大工具，分为全局比对和局部比对两类，各以Needleman-Wunsch算法和Smith-Waterman算法为代表。由于这些算法都是启发式（heuristic）的算法，因此并没有最优值。根据比对的需要，选用适当的比对工具，在比对时适当调整空格罚分（gap penalty）和空格延伸罚分（gap extension penalty），以获得更优的比对。
  除了利用BLAST、FASTA等局部比对工具进行序列对数据库的搜索外，我们还推荐使用EMBOSS软件包中的Needle软件（http://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/），和Pairwise BLAST
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。以上介绍的这些双序列比对工具的使用都比较简单，一般输入所比较的序列即可。

（1）BLAST和FASTA
  FASTA（http://www.ebi.ac.uk/fasta33/）和BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）是目前运用较为广泛的相似性搜索工具。这两个工具都采用局部比对的方法，选择计分矩阵对序列计分，通过分值的大小和统计学显著性分析确定有意义的局部比对。使用FASTA和BLAST，进行数据库搜索，找到与查询序列有一定相似性的序列。一般认为,如果蛋白的序列一致性为25-30%,则可认为序列同源。BLAST根据搜索序列和数据库的不同类型分为5种（表2），另外PSI-BLAST通过迭代搜索，可以搜索到与查询序列相似性较低的序列。其中BLASTN、BLASTP在实践中最为常用，TBLASTN在搜索相似序列进行新基因预测时特别有用。
  使用BLAST时，先选择需要使用的BLAST程序，然后提供相应的查询序列，选择所比对的数据库即可。

(2)Needle和Pairwise BLAST：其中Needle适用于蛋白质和DNA序列，而Pairwise BLAST仅适用于DNA序列

（3）相似性和同源性：必须指出，相似性（similarity）和同源性( homology)是两个完全不同的概念。同源序列是指从某一共同祖先经过趋异进化而形成的不同序列。相似性是指序列比对过程中检测序列和目标序列之间相同碱基或氨基酸残基序列所占比例的大小。经过比对，当相似性高于一定程度，可以推测序列可能是同源序列，具有一定同源性。

2、多序列比对和进化树
  在研究生物问题时，常常需要同时对两个以上的序列进行比对，这就是多序列比对。多序列比对可用于研究一组相关基因或蛋白，推断基因的进化关系，还可用于发现一组功能或结构相关基因之间的共有模式（pattern）。最常用的多序列比对工具为ClustalW（http://www.ebi.ac.uk/clustalw/），多用于比较蛋白序列。
ClustalW用法：
（1）输入：序列以FastA格式输入。
（2）输出：除了以文本形式外，还可以通过JalView显示和编辑结果。此外，还可以另外使用GeneDoc（常见于文献）及DNAStar软件等显示结果。多序列比对的结果还用于进一步绘制进化树。

3、ORF(Open Reading Frame)分析
  从核酸序列翻译得到蛋白质序列，需要进行ORF分析，每个生物信息学分析软件包几乎都带有翻译功能。推荐使用NCBI的ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）软件或EMBOSS中的getorf（http://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/）软件。ORF Finder 以图形方式，分为正链+1、＋2、＋3和反链＋1、＋2、＋3六个相位预测ORF；Getorf可指定预测ORF的长度下限和指定预测正反链。进行ORF分析虽然比较简单，但应注意以下几点：
（1）序列的准确性：尤其是通过计算机拼接的序列，需要根据EST和基因组序列进行反复校正。
（2）ORF是否完整：看在ORF上游同一相位是否具有终止码，或者具有起始密码子。
（3）参考Kozak一致性规律，即起始密码子位点符合A/GCCATGG。
（4）不要忽略反义读框。

4、染色体定位
  根据基因组图谱对序列进行染色体定位和浏览其基因组上下游基因。具体方法为：（1）进行Genomic BLAST搜索。（2）通过“Genome view”观察基因组结构。（3）点击相应染色体区域，通过表意图（ideogram）和相应区域上下游的基因进行精确定位。

5、基因结构分析
  根据基因的mRNA序列及基因组序列，可以进行基因结构的分析。推荐使用BLAST或BLAT(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start)进行分析。由于真核生物转录后内含子将被剪切，因此将mRNA和基因组进行比对以后，会发现mRNA的每个外显子与基因组序列片断匹配，根据这些片段可以判断外显子的数目和大小。外显子和内含子具体边界的确定，可以参考GT/AG一致性规则。BLAT的结果直接显示外显子数目、大小及边界。

6、基因上游调控区分析
（1）启动子预测：推荐使用冷泉港开发的FIRSTEF程序（http://rulai.cshl.org/tools/FirstEF/）进行启动子预测。用RT-PCR等实验方法获得的mRNA往往缺少完整的5’端，采用FirstEF 程序可以对第一外显子（尤其是非编码的第一外显子）和CpG相关启动子进行预测。
  方法：以FastA格式输入起始密码子上游序列。
（2）转录因子结合位点分析：推荐使用TFSEARCH程序（http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html）及MATCH程序
（http://www.gene-regulation.com/pub/programs.html#match）对转录因子数据库TRANSFAC（http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/）进行搜索，寻找可能的转录因子结合位点。
方法：输入起始密码子上游序列。结果将给出很多可能的转录因子结合位点，注意选择其中分值较高的位点。

（二） 蛋白质序列分析
1、跨膜区预测
  各个物种的膜蛋白的比例差别不大，约四分之一的人类已知蛋白为膜蛋白。由于膜蛋白不溶于水，分离纯化困难，不容易生长晶体，很难确定其结构。因此，对膜蛋白的跨膜螺旋进行预测是生物信息学的重要应用。
  推荐使用TMHMM软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对蛋白进行跨膜预测。TMHMM综合了跨膜区疏水性、电荷偏倚、螺旋长度和膜蛋白拓扑学限制等性质，采用隐马氏模型（Hidden Markov Models），对跨膜区及膜内外区进行整体的预测。TMHMM是目前最好的进行跨膜区预测的软件,它尤其长于区分可溶性蛋白和膜蛋白，因此首选它来判定一个蛋白是否为膜蛋白。所有跨膜区预测软件的准确性都不超过52％，但86％的跨膜区可以通过不同的软件进行正确预测。因此，综合分析不同的软件预测结果和疏水性图以获得更好的预测结果。
方法：输入待分析的蛋白序列即可。

2、信号肽预测
  信号肽位于分泌蛋白的N端，当蛋白跨膜转移位置时被切掉。信号肽的特征是包括一个正电荷区域、一个疏水性区域和不带电荷但具有极性的区域。信号肽切割位点的-3和-1位为小而中性氨基酸。
推荐使用SignalP软件2.0版（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/）对PDCD5N端序列进行信号肽分析。SignalP2.0根据信号肽序列特征，采用神经网络方法或隐马氏模型方法，根据物种的不同，分别选择用真核和原核序列进行训练，对信号肽位置及切割位点进行预测。信号肽切割位点预测用Y-score maximum来判断，对是否分泌蛋白用mean S-score来判断：如果mean S-score大于0.5，则预测为分泌蛋白，存在信号肽，但II型跨膜蛋白的N端序列可能被错误预测为分泌蛋白的信号肽。
方法：输入待分析的蛋白序列，如为原核基因选择原核训练集，否则选择真核训练集。

3、亚细胞定位预测
  亚细胞定位与蛋白质的功能存在着非常重要的联系。亚细胞定位预测基于如下原理：（1）不同的细胞器往往具有不同的理化环境,它根据蛋白质的结构及表面理化特征,选择性容纳蛋白。（2）蛋白质表面直接暴露于细胞器环境中,它由序列折叠过程决定,而后者取决于氨基酸组成。因此可以通过氨基酸组成进行亚细胞定位的预测。
  推荐使用PSORT（http://psort.nibb.ac.jp/）II软件对PDCD5蛋白的细胞内定位进行预测。PSORT将动物蛋白质定位于10个细胞器：（1）细胞浆，（2）细胞骨架，（3）内质网，（4）胞外，（5）高尔基体，（6）溶酶体，（7）线粒体，（8）胞核，（9）过氧化物酶体（peroxisome）和（10）细胞膜。

DNA序列分析技术路线图

cDNA
Featues
AATAAA signal,Polyadenylation
Electronic elongation(EST)
ORFs(ORF Finder, getorf)
Restriction site(DNASIS)
Expression profile
EST
SAGEmap,SAGE Genie
Microarray(WormBase)
Genomic sequence
Features
chromosome location(Human Genome)
MW, base compositon(DNAMAN)
Exon-intron(SIM4)
Repeats(RepeatMasker)
SNPs(dbSNP, TSC)
5′ flanking sequence
Promoter, TATA box(FIRSTEF)
CpG island(cpgplot)
Transcription factor binding site(TFSEARCH, match)
Novel gene prediction(EST, stackPACK)

蛋白序列分析技术路线图

Protein
features
MW,pi,AA composition(EMBOSS)
Hydrophobicity(BioEdit)
Transmembrane region(TMHMM)
Signal peptide(Signal P)
subcellular location(PSORT)
Coiled coil(COILS)
Antigenic site(DNAStar)
Function inference
Gene knockouts(WormBase)
Similarity search
Alignment(BLAST,FASTA,CLUSTALW)
Phylogenic analysis(DNANAN)
Genome context(COG)
Motif,profile,domain(PROSITE,Pfam,SMART)
Expression ‘topology’(WormBase)
Structure information
Secondary structure prediction(PHP)
Structure classification(SCOP)
Structure modeling(HOMOLOGY,DISCOVER)
Binding site analysis(Binding site)